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本案例基于pAZV5分泌表达体系，使用基因合成的方法构建pAZV5表达载体，瞬时转染HEK293悬浮细胞，通过SDS-PAGE和 Western Blot检测蛋白的表达情况，扩大培养收集细胞上清并通过Ni柱的亲和纯化获得目的蛋白。
一、实验设计?
我们分析客户提供的Target-Gene序列，整个蛋白序列呈亲水性，自身不带信号肽序列，因此我们设计思路为：
1.1、以客户的基因序列翻译的蛋白序列为源模板，通过密码子优化一套最适宜HEK293细胞系的基因序列。
1.2、推荐客户使用钟鼎生物的自主载体pAZ-V5载体来进行实验，利用载体自带的V5信号肽序列帮助蛋白穿膜分泌表达至胞外，为了保持蛋白的N端活性，我们在C端添加6XHis-Tag便于重组蛋白的检测和亲和纯化。
依据上述设计思路，以基因合成的方式构建pAZ-V5表达质粒，经过测序和酶切验证无误后，挑取无内毒素的质粒。转染200ml HEK293细胞，通过western blot检测蛋白表达情况，确认蛋白表达情况，再通过Ni-resin亲和纯化获得80%以上目的蛋白。
二、试剂和耗材
名称 公司 名称 公司
DMEM 高糖、DMEM低糖、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、低熔点琼脂糖Sigma公司
抽提试剂盒Axygen公司PCR试剂盒IO-RAD公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司PCR反应管Fisher公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒AXYGEN公司Agarose上海基因公司
中性红碧云天生物公司其它试剂均为国产分析纯
二、主要实验仪器
仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团
四、蛋白性质分析
4.1 客户提供原始基因序列
GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT
4.2 编码的蛋白序列如下（理论分子量41.18KD，理论等电点PI6.73）
GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客户研究内容，不予显示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL
4.3 稀有密码子序列分析如下图所示（红色：使用频率低于10% 灰色：使用频率低于20%，绿色为正常频率密码子）
4.4 蛋白序列跨膜及亲疏水性分析
4.5 信号肽预测
综上所述：
1、蛋白理论分子量为 41KD，属于正常分子量范围，较适宜表达。
2、通过对基因密码子使用频率的分析，如果以293细胞为表达宿主，基因序列上使用频率低于20%的密码子X个，使用频率低于10%的密码子X个，优化后通过基因合成方式获得目的基因。
3、通过对蛋白的跨膜结构和亲疏水性分析，蛋白整体呈亲水性，但从473AA之后，蛋白存在典型的跨膜结构，建议去除后表达以提高成功率。
4、目的蛋白自身无信号肽，添加GP67信号肽便于蛋白分泌表达。为了纯化方便，考虑在C端添加His标签。
五、实验方法及实验结果
5.1 pAZ-V5表达质粒构建
采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，双酶切连接至pAZ-V5载体的Afl II和Xba I之间；将获得的重组质粒转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如下所示，单划线区为目的基因基因区域。紫色区域为酶切位点，**区域为v5信号肽，绿色区域为6XHis标签；
T A G C A G A G C T C T C T G G C T A C T A G A G A A C C C A C T G C T T A C T G G C T T A T C G A A A T T A A T A C G A C T C A C T A T A G G G A G A C C C A A G C T G G C T A G C G T T T A A A C T T A A G C * * X 3 * * * * N N N N N N---略-----N N N N N N * * T G A G T A G G C A C C A C C A C C A C C A C C A C T G A C T C T A G A G G?
5.2 使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：
5.3 pAZ-V5载体图如下所示：
表达条件优化
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药理学实验给药速度对药物作用的影响实验结果是什么
摘要
目的：探讨治疗效果的N -乙酰氨基葡萄糖（葡萄糖）的实验兔骨关节炎（ OA ） 。
方法：实验办公诱导兔前交叉韧带横断（ ACLT ） 。在第一项研究，兔（每组6 ）收到肌内注射葡萄糖或生理盐水，每周3次，术后1周开始。在第二项研究中，兔（ 8每组）注射内articularly与葡萄糖（或一次或两次周）或生理盐水。在第三项研究，兔子（ 7每组）注射内articularly每周两次带有葡萄糖，透明质酸，或生理盐水。动物处死后8周ACLT的宏观和组织学评估膝关节。
结果：肌肉注射管理葡萄糖兔膝关节炎的实验并没有显示chondroprotective轻微影响，但表明抗炎活性。与此相反，关节腔内管理葡萄糖每周两次减少软骨退化。此外，关节内葡萄糖也抑制滑膜炎。每周一次关节腔内注射的葡萄糖没有证明治疗效果。该chondroprotective疗效葡萄糖优于viscosupplementation治疗透明质酸。
结论：关节内葡萄糖已chondroprotective及抗炎活性的实验办公。
简称： ACLT ，前十字韧带横断;聚糖，糖胺聚糖;全球土地覆盖物网络，葡萄糖，葡萄糖， N - acetylglucosamine一起，关节炎，骨关节炎
关键词： N -乙酰氨基葡萄糖;软骨;膝盖骨关节炎
骨关节炎（ OA ）是最常见的关节病，其中的特点是渐进的软骨退变，软骨下骨的变化，目前治疗慢性synovitis.13的OA是有限的症状管理，止痛，消炎药，并viscosupplementation devices.47氨基葡萄糖（全球土地覆盖物网络）是广泛用于治疗关节炎和可修改疾病活动。有人认为，全球土地覆盖物网络延迟逐步联合空间narrowing8 ，提高了生物力学的OA膝joints9即使没有疼痛relief.8 ， 9,10,11
机制的全球土地覆盖物网络导抗关节炎活动仍有待确定。的限制，在体外研究全球土地覆盖物网络的是，抗炎和chondroprotective全球土地覆盖物网络的影响主要是观察浓度较低millimolar ， 12,13超过该范围的治疗浓度得到口头全球土地覆盖物网络的一个因素十万三千一百○四点一四一六虽然最大反关节炎疗效的全球土地覆盖物网络及其衍生物可以预期后，关节内管理的糖浓度高时，详细分析当地使用这些代理人尚未公布。
在这项研究中N - acetylglucosamine一起（葡萄糖）被选定为首选的代理人关节内管理。这是基于我们以前的意见，即葡萄糖是比全球土地覆盖物网络更有效地抑制白细胞介素1 ？导激活人关节软骨细胞在vitro.13此外，全球土地覆盖物网络在浓度超过10 mmol / L的显着降低体外培养软骨细胞的可行性， 17,18构成潜在复杂的关节内administration.18相反，葡萄糖不诱导软骨细胞死亡甚至在浓度高于50 mmol/l.18
本研究分析了抗关节炎活动内部articularly管理葡萄糖兔膝关节炎引起的前十字韧带横断（ ACLT ） 。三个独立的实验进行。第一份研究报告审查的功效肌注管理葡萄糖。第二项研究确定了抗关节炎活动关节内葡萄糖和最佳频率的注射。第三个研究比较的功效关节内葡萄糖与关节腔内透明质酸，这是一个viscosupplementation装置目前使用的治疗膝关节OA.7
材料与方法
试剂
葡萄糖是购买适马（圣路易斯，密苏里州） 。这是溶解在生理盐水和消毒过滤通过0.22微米的过滤器（康宁，阿克顿，马） 。无菌解决方案的葡萄糖存放在4 ° C的透明质酸钠（ Hyalgan ）购买了由赛诺菲圣德拉堡（纽约） 。
动物
新西兰白兔，年龄812个月，体重3.74.2公斤，与封闭骨骺，使用了所有的实验。所有的研究进行了符合美国的实验动物科学的指导方针和经批准后斯克里普斯研究所和美国加州大学圣地亚哥动物审查委员会。共有57只兔试验中使用。
ACLT
单边或双边ACLT进行所示为每一组实验中使用的是内侧arthrotomy technique.19所有的动物都保持单独和自由活跃。这些动物被打死8周后进行手术。此前公布的数据显示，多数兔软骨退变ACLT发展这个time.20 ， 21
肌内注射葡萄糖
肌内注射葡萄糖进行每周3次，术后1周开始，为期7周。葡萄糖胺的剂量是200毫克/千克每注射。对照组相同数量的肌内注射生理盐水。
关节腔内注射的葡萄糖和透明质酸
关节腔内注射的葡萄糖，术后1周开始，为期7周。家兔注射一次或两次，每周葡萄糖的量0.3毫升每个膝关节。单剂量的葡萄糖注射液是每80毫克。控制动物每周两次注射内articularly生理盐水（ 0.3毫升为联合） 。关节腔内注射透明质酸（ 3 mg/0.3毫升每联合） ，术后1周开始，为期7周。滑液分析，在三个动物谁开发总滑膜积液（两个动物对照组，一个在透明质酸组） 。在所有这三个动物的关节液的培养阴性。
毛形态评估膝关节
毛形态评估膝关节进行了双盲的方式，包括评价胫骨平台和股骨髁。
股骨远端和胫骨近端收获，使三点五四厘米轴的骨头。关节软骨表面的每个标本覆盖解决方案，其中包括印度墨水（埃伯哈德花，刘易斯堡，田纳西州）的磷酸盐缓冲液（ 1:5比例） 。超过墨水的解决办法是删除温柔印迹用纸巾是预先润湿与磷酸盐缓冲液。随后，所有关节拍照和数码图像进行了分析。
分级制度的关节软骨的评估结果如下：
1级（完整表面）表面是正常的外观和不保留墨汁
二级（最小颤动）表面保留墨汁作为拉长斑点或浅灰色补丁
三级（公开颤动）领域的天鹅绒般的外观和留住墨汁那样黑补丁
四级（侵蚀）损失软骨暴露骨骼。
数码影像
关节面的股骨和胫骨髁被轻轻剥离高原干燥和清洁的松散组织。每一股骨干是贴近光学替补。（分辨率： 60像素/平方毫米;屏幕放大： 20倍）的股骨髁获得使用佳能EOS D30数码相机的100毫米微距镜头，在距离大约12厘米。毫米的规模被列入拍摄到的图像准确规模。规模图像，然后投影到三维模型的股骨髁。三维表面积病变检测交互阴谋的边缘病变。数字图像的关节面的胫骨获得如上所述。三维投影没有使用，因为胫骨表面比较平坦和二维测量并不会有很大差异三维测量。
组织学分级的膝关节
股骨远端和胫骨近端从兔膝关节固定在10 ％缓冲福尔马林，脱钙在待定- 2 decalcifier （ ThermoShandon ，匹兹堡， CA ）和石蜡包埋块。矢状切面外侧和股骨内侧髁和胫骨冠状节高原被用于组织学分析。
评估硫酸糖胺聚糖（粘多糖）的内容进行染色后的组织切片与番红的O /固绿。
组织学评估滑膜炎的基础是存在的滑膜增殖和绒毛结构，并进行单独为滑膜附着在胫骨平台，外侧和股骨内侧髁。滑膜衬里单层无绒毛结构被认为是正常的（ 0级） 。肥厚性滑膜和滑膜绒毛内容与被认为是不正常的（一级） 。
统计分析
统计分析实验数据采用Fisher的精确检验和两个尾t检验：两个样本配对的手段（数字数据分析） 。
结果
肌内葡萄糖与实验兔骨关节炎
抗关节炎活性葡萄糖是3个独立的评估组实验。首先分析了一系列的实验活动的管理，高剂量葡萄糖通过肌内注射。肌肉注射的疗效评估中的葡萄糖6兔双边ACLT并与对照组6只兔子，谁也经历了双边ACLT并收到肌肉注射生理盐水注射。毛形态分析胫骨平台和股骨髁没有表现出显着差异的程度与葡萄糖软骨损伤治疗和控制动物。组织学检查的膝关节没有表现出统计学显着性差异软骨硫酸粘多糖含量，软骨完整，软骨细胞治疗性克隆之间的葡萄糖和生理盐水注入兔。葡萄糖治疗兔呈下降趋势滑膜扩散与对照组比较。总体而言，肌肉注射葡萄糖注射实验兔骨关节炎没有证明chondroprotective疗效，但轻微减少滑膜炎。
抗关节炎活动关节内葡萄糖
作为最大的生物活性的葡萄糖在体外被视为低millimolar浓度， 13日，我们检查的效率高剂量关节内葡萄糖治疗骨关节炎的实验。试验包括三组兔。家兔在第一组治疗关节内葡萄糖注射液，每周两次;兔第二组治疗关节内葡萄糖注射每周一次;和第三组家兔收到关节内生理盐水。期间的待遇是7周。
毛形态分析表明，股骨髁对待动物每周两次与关节内葡萄糖有减少的趋势软骨病变的严重程度相比，对照组（ P “ 0.11 ） ;每星期一次关节内管理葡萄糖显示没有显着的好处（图1A ） 。类似的结果表明，在分析胫骨平台：葡萄糖注射液，每周两次都与一个有益的治疗趋势，磷“ 0.18 （图1B ）款。统计学上的意义没有实现，可能由于规模小的群体。
结果宏观等级确认了数字图像分析的软骨病变。平均值（标准差）软骨病变面积控制股骨髁是14.34 （ 12.86 ） mm2v 4.40 （ 7.57 ）平方毫米兔每周两次治疗（ p “ 0.02 ） 。每周一次葡萄糖政府没有显着减少软骨病变区（ 13.74 （ 12.71 ）平方毫米，磷“ 0.88 ） 。
一般情况下，关节软骨病变的胫骨平台是小于股骨髁上，很可能反映了保护作用，半月板的胫骨软骨degeneration.20虽然治疗家兔每周两次与葡萄糖有病变小于50 ％的人控制组（ 3.76 （ 6.69 ） mm2v 7.90 （ 8.44 ）平方毫米） ，由于数量有限的实验动物，在群体之间的差异并不显着（ P “ 0.29 ） 。治疗家兔每周一次与葡萄糖没有表现出显着差异，与对照组（平均软骨病变面积9.59 （ 6.31 ）平方毫米，磷“ 0.48 ） 。
最后，每周两次关节内管理葡萄糖优于每周一次关节内葡萄糖和生理盐水注射减少的严重程度的软骨退变的OA ACLT模型。
疗效关节内葡萄糖相比，关节腔内透明质酸
各项目标的第三份研究报告证实了独立的chondroprotective效果关节内给予葡萄糖注射液，每周两次，并比较疗效关节内葡萄糖注射关节腔内注射透明质酸，它被用来作为viscosupplementation治疗膝OA.2325为此，家兔是单方面ACLT内articularly每周两次注射7周的葡萄糖（ 7只） ，或透明质酸（ 7只） ，或生理盐水（ 7只） 。
毛形态分析表明股骨髁趋势改善软骨病变的葡萄糖治疗动物相比，控制和透明质酸治疗组，磷“ 0.10 （图2a ） 。
检查胫骨平台披露了显着的chondroprotective活动的葡萄糖，因为只有1 / 7兔软骨病变的发展，而6月7日动物盐水注射组和5月7日透明质酸治疗兔显示软骨病变（图2b ） 。该chondroprotective影响葡萄糖统计优于生理盐水组（ P “ 0.013 ）和透明质酸治疗组（ P ” 0.034 ） 。
数字图像分析股骨髁（图3a ）和胫骨的高原（图3b ）由葡萄糖治疗动物与动物透明质酸治疗的趋势表现出更大的功效葡萄糖与透明质酸。
两者合计，结果第三一系列实验证实，治疗效果的葡萄糖注射液管理的每周两次，并表明他们的上级chondroprotective活动相比，关节内透明质酸治疗。
组织学分析
膝关节由7个控制兔子和六个葡萄糖治疗兔（从第三份研究报告）用于组织学分析。一个兔子从葡萄糖治疗组排除在研究由于确定包涵体在关节软骨。
损失由软骨硫酸粘多糖在股骨内侧髁和胫骨平台也与此相似葡萄糖治疗和控制作用（见表1 ） 。在股外侧髁的葡萄糖治疗家兔表明趋势减少硫酸粘多糖损失相比，控制动物（ p “ 0.056 ） 。审查表明软骨完整的趋势chondroprotective活动的胫骨平台，磷“ 0.10 （见表1 ） 。
讨论
目前的药物治疗骨关节炎是有限的，以缓解疼痛和改善粘弹特性的滑液，但这些措施不具备结构调整的活动。最近的结果多中心临床试验表明，口服全球土地覆盖物网络可以减少损失在OA软骨joints.8尽管广泛使用的全球土地覆盖物网络与办公自动化的病人中，只有有限的数据，其活性在实验性关节炎有。家兔实验性关节炎口服全球土地覆盖物网络略有改善的形态学级的OA lesions.26在实验性关节炎引起的关节内注射木瓜凝乳蛋白酶，口腔全球土地覆盖物网络保存软骨硫酸糖胺多糖含量显着恶化，但病理changes.27的机制占全球土地覆盖物网络骨关节炎关节的影响目前还不清楚。其最佳的实验研究活动的观察millimolar的集中，就不可能实现这种口服administration.1216浓度可与关节腔内注射。基于我们以前的意见，这表明，在体外抗炎活性和细胞毒性的葡萄糖优于全球土地覆盖物网络， 13,18本研究旨在探讨抗关节炎活性高剂量葡萄糖注射后在体内与内关节行政与实验兔骨关节炎。
实验性关节炎家兔诱导ACLT 。这是一个最广泛使用的模型，研究疾病的治疗OA.28修改ACLT结果异常膝关节生物力学，包括增加前抽屉在推广和90 °的屈曲，以及增加内部轮换类似看待办公自动化knees.28人类最严重的地区的软骨退变兔ACLT发生在股骨内侧髁其次是股外侧condyles.28在胫骨平台ACLT原因轻度至中度关节炎病变领域没有涵盖的menisci.22
肌内管理葡萄糖实验兔骨关节炎没有证明chondroprotective影响，但表现出减少的趋势滑膜炎。在两个独立的研究，每周两次关节内管理葡萄糖显示减少软骨退化。每周一次关节内葡萄糖注射未能证明治疗效果。
炎症变化与ACLT模型包括关节积液和滑膜增生， 29日这是一个重要机制的关节疼痛患者OA.30 ， 31日在本研究中我们观察抗炎活动关节内葡萄糖与减少在严重的结节性滑膜炎。观察抗关节炎影响的葡萄糖，可部分的后果的能力，制止炎症反应。的直接影响葡萄糖对软骨细胞包括抑制白细胞介素1的反应，如抑制表达诱导型一氧化氮合酶和环氧oxygenase.13这可能防止细胞死亡和软骨基质降解。葡萄糖胺也抑制炎症反应的影响进行慢性腹膜dialysis.32此外，口服葡萄糖，成功地用来控制炎症的儿童克罗恩病和溃疡性colitis.33
除其他葡萄糖特性有助于其抗关节炎活动是一个刺激作用透明质酸合成的人关节软骨细胞和滑膜fibroblasts.34增产透明质酸接触葡萄糖后，也被视为在人腹膜间皮细胞和fibroblasts.35慢性腹膜透析的葡萄糖溶液补充原因积累聚糖在腹膜间和减少腹膜permeability.36
我们的研究包括了比较抗关节炎疗效葡萄糖与透明质酸。从实验结果和有限的办公自动化镜下观察表明，在人类透明质酸具有轻度chondroprotective及抗炎activities.3739与透明质酸，内部articularly管理葡萄糖生理盐水具有更短半衰期（分钟为葡萄糖与小时透明质酸（三宝黄，未公布的数据） ） 。然而，在实验性关节炎表现出更好的疾病葡萄糖修改活动比透明质酸。这一观察打开了一个渠道的设计与优化的葡萄糖制剂药代动力学参数，以获得更大的治疗效果在OA 。
不良反应与系统或本地管理葡萄糖没有看到在这项研究中。公布的数据还表明，葡萄糖具有优良的安全性在人类。静滴高达100克/小时的葡萄糖在成年健康volunteeres是很好的耐受性。没有重大变化血清葡萄糖和氨浓度noticed.40口服或直肠给药的葡萄糖儿童炎症性肠病还没有产生不利reactions.33
总之，本研究确定了葡萄糖的前n -乙酰氨基糖与疾病修改和抗炎活性的实验办公。
致谢
我们感谢星际克莱顿- Achermann优秀的技术帮助，组织学分析和博士詹姆斯科焦乌提供帮助与统计分析的数据。
这项工作得到了美国国立卫生研究院资助AG07996 ， AT00052 ，和AR46990 。
考
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目的：观察不同剂量尼可刹米对小鼠作用的差异。
原理：影响药物的因素有药物的给药速度，当给药速度增加，药物的效应也随之增加。但这一效应的增加不是无限制的，当增加到一定的程度时，药物的效应恒定在一定的水平。
器材：电子天平、1ml注射器。
药品：2.5%尼可刹米溶液。
动物：小白鼠3只。?
方法：取小鼠3只，标记，称重，随机分为3组，各鼠均腹腔注射不同剂量的尼可刹米溶液（1：2.5%尼可刹米溶液0.15ml/10g；2：2.5%尼可刹米溶液0.1ml/10g；3：2.5%尼可刹米溶液0.05ml/10g），观察潜伏期、给药前后的表现，并仔细记录观察结果。
结果：当给药速度增加，药物的效应也随之增加。但这一效应的增加不是无限制的，当增加到一定的程度时，药物的效应恒定在一定的水平。
扩展资料
大多数药物需进入血液分布到作用部位才能发生作用。药物自给药部位进入全身血液循环的过程为吸收，吸收速度的快慢以及吸收数量的多少都会直接影响药物的起效时间及强度，而除了给药速度之外，给药的途径也是决定药物起效时间及强度的重要因素之一。
百度百科-给药途径
百度百科-药效实验
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